आज, आइए उस समस्या के बारे में बात करते हैं जिसने अनगिनत शोध सहयोगियों के सिरदर्द - पश्चिमी धब्बा (डब्ल्यूबी) प्रयोग किया है। यह सरल रूप से सरल लेकिन "जाल" प्रयोग से भरा है, यह हमेशा हमें बार -बार ठोकर क्यों बनाता है? अब आइए एक साथ विफलताओं के कारणों की समीक्षा करें।
I. कोई बैंड नहीं
संभावित कारणों में शामिल हो सकते हैं:
- एंटीबॉडी के मुद्दे: एंटीबॉडी अप्रभावी, निरर्थक, या लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्यकारी नहीं हो सकता है।
- नमूना मुद्दे: नमूने में हस्तक्षेप करने वाले पदार्थ हो सकते हैं, एकाग्रता में बहुत कम हो सकते हैं, या पहले से ही अपमानित हो सकते हैं।
- वैद्युतकणसंचलन मुद्दे: अनुचित वैद्युतकणसंचलन की स्थिति, जैसे कि वोल्टेज, समय, या बफर का अनुचित उपयोग।
- ट्रांसफर इश्यूज़: ट्रांसफर प्रक्रिया के दौरान समस्याएं, जैसे कि अनुचित झिल्ली चयन, ट्रांसफर टाइम या ट्रांसफर बफर।
- अवरुद्ध मुद्दे: अवरुद्ध समाधान अनुचित हो सकता है या अवरुद्ध समय बहुत लंबा हो सकता है।
- धुंधला मुद्दे: धुंधला अभिकर्मक समाप्त हो सकता है, असंवेदनशील, या अनुचित तरीके से उपयोग किया जा सकता है।
उपकरण के मुद्दे: उपकरण खराबी हो सकते हैं या ठीक से कैलिब्रेट नहीं किया जा सकता है।
- प्रायोगिक संचालन मुद्दे: प्रयोगात्मक संचालन को मानकीकृत नहीं किया जा सकता है, जैसे कि अपर्याप्त धोने या असमान नमूना लोडिंग।
- प्रोटीन संशोधन मुद्दे: लक्ष्य प्रोटीन एंटीबॉडी मान्यता को रोकने वाले पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों से गुजर सकता है।
- लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति के मुद्दे: लक्ष्य प्रोटीन में बहुत कम अभिव्यक्ति हो सकती है या कोशिकाओं या ऊतकों में कोई अभिव्यक्ति नहीं हो सकती है।
Ii। उच्च पृष्ठभूमि
संभावित कारणों में शामिल हो सकते हैं:
- उच्च एंटीबॉडी एकाग्रता: बहुत अधिक एंटीबॉडी का उपयोग करने से निरर्थक बंधन में वृद्धि हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि होती है।
- एंटीबॉडी गुणवत्ता के मुद्दे: एंटीबॉडी में अन्य प्रोटीन के साथ उच्च निरर्थक बाध्यकारी या क्रॉस-रिएक्ट हो सकता है।
- अपर्याप्त अवरुद्ध: अवरुद्ध समाधान झिल्ली पर गैर -बाध्यकारी बाध्यकारी साइटों को प्रभावी ढंग से कवर करने में विफल रहता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि होती है।
- झिल्ली मुद्दे: झिल्ली में खराब गुणवत्ता या संदूषण हो सकता है, जिससे उच्च पृष्ठभूमि हो सकती है।
- अधूरा स्थानांतरण: हस्तांतरण प्रक्रिया के दौरान, प्रोटीन को झिल्ली पर पूरी तरह से स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि होती है।
- अपर्याप्त धुलाई: धोने के कदम प्रभावी रूप से अनबाउंड एंटीबॉडी या अन्य अशुद्धियों को दूर करने में विफल होते हैं, जिससे उच्च पृष्ठभूमि होती है।
- धुंधला अभिकर्मक मुद्दे: धुंधला अभिकर्मक बहुत संवेदनशील या अस्थिर हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि होती है।
- प्रायोगिक उपकरण मुद्दे: उपकरण में रिसाव या हस्तक्षेप हो सकता है, जिससे उच्च पृष्ठभूमि हो सकती है।
- प्रोटीन नमूना मुद्दे: नमूने में बड़ी मात्रा में हस्तक्षेप करने वाले पदार्थ हो सकते हैं, जैसे कि प्रोटीन गिरावट उत्पाद या अन्य अशुद्धियां।
- प्रायोगिक संचालन मुद्दे: प्रयोगात्मक संचालन को मानकीकृत नहीं किया जा सकता है, जैसे कि लंबे समय तक ऊष्मायन समय या उच्च तापमान।
Iii। Nonspecific बैंड या गलत प्रोटीन बैंड आकार
संभावित कारणों में शामिल हो सकते हैं:
- कोशिकाओं के बहुत सारे मार्ग, जिसके परिणामस्वरूप अलग -अलग प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर होता है, जिससे असंगत बैंड आकार या कई बैंड की उपस्थिति होती है।
- प्रोटीन नमूना गिरावट, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन आणविक भार या कई बैंड की उपस्थिति होती है।
- विवो व्यक्त प्रोटीन के नमूनों में विभिन्न प्रकार के संशोधनों जैसे कि एसिटिलेशन, मेथिलिकेशन, अल्काइलेशन, फॉस्फोराइलेशन और ग्लाइकोसिलेशन हो सकते हैं, जिससे असंगत बैंड आकार या कई बैंड की उपस्थिति होती है।
- लक्ष्य प्रोटीन में कई आइसोफॉर्म या स्प्लिस वेरिएंट होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप असंगत बैंड आकार या कई बैंड की उपस्थिति होती है।
